离子液体柱——脂质组学中分离脂肪酸的气相色谱柱
编者注：傅 若农教授生于1930年，1953年毕业于北京大学化学系，而后一直在北京理工大学(原北京工业学院)从事教学与科研工作。1958年，傅若农教授开始带 领学生初步进入吸附柱色谱和气相色谱的探索;1966到1976年文化大革命的后期，傅若农教授在干校劳动的间隙，系统地阅读并翻译了两本气相色谱启蒙 书，从此进入其后半生一直从事的事业——色谱研究。傅若农教授是我国老一辈色谱研究专家，见证了我国气相色谱研究的发展，为我国培养了众多色谱研究人才。
第九讲：傅若农：凌空一瞥洞察一切——神通广大的固相微萃取（SPME）
第十讲：傅若农：悬“珠”济世——单液滴微萃取(SDME)的妙用
前言
作为代谢组学的重要分支之一，脂质组学(Lipidomics)的研究对象是生物体的所有脂质分子，并以此为依据推测其它与脂质作用的生物分子的变 化，进而揭示脂质在各种生命活动中的重要作用机制。脂质组学是总体研究和这些疾病有关的脂质化合物，找到昭示这些疾病的生物标记物。
前一篇讲述了脂质组学研究中的样品处理技术，一般情况下样品处理后可以直接用鸟枪法进行质谱分析，但是如果是一个成分复杂的系统，就要进行分离，可以用气相色谱、液相色谱、薄层色谱或毛细管电泳，本文介绍代谢组学研究中使用离子液体色谱柱分离脂肪酸的气相色谱方法。
1、基本情况
由于脂质分子是不挥发性的化合物，同时有些脂质分子受热易于降解，所以在脂质组学研究中使用气相色谱有些困难，逊色于薄层色谱和液相色谱。如果使用气 相色谱进行衍生化是必须的步骤，但是很多情况下衍生化会丧失脂质分子种类特点的结构信息。但是由于气相色谱以其对异构体的高分离能力、高灵敏度、便于进行 定量分析的能力，它仍然是脂质组学分析中的有力工具。通常气相色谱用于分析某些类别的脂质，可以获得很高的分离度和灵敏度，所以经过很特殊的萃取、用 TLC 或 HPLC与分离、再经衍生化是用气相色谱进行脂质组学研究的基本方法。用气相色谱可以很灵敏地检测许多类别的脂质，如脂肪酸、磷脂、鞘脂类、甘油酯、胆固 醇和类固醇。分析高分子量的化合物，必须使用高柱温，甚至需要>400 C，近年Sutton等配置了高温气相色谱-飞行时间质谱，这一系统可以进行高分子量化合物(m/z达1850)，进行在线质谱分析温度达430℃，这样 的系统适合于长链脂质的分析。
近年把离子液体用作气相色谱固定相，用以分离脂质混合物，特别是脂质的异构体。Delmonte等讨论了脂肪酸顺反异构体的分离问题，一些单不饱和脂 肪酸的几何和位置异构体可以得到很好的分离。使用这一方法对18:1 FFA的各种异构体可以分离出10个单独的峰，此后使用这一方法分析了人头发、指甲等实际样品，因此建议使用离子液体毛细管色谱柱分析全脂肪酸或脂肪酸甲 酯，这种固定相适合于脂质组学，得到更多脂质分子的种类信息。(刘虎威研究组，Anal Chem, 2014, 86, 161−175)
2、室温离子液体作气相色谱固定相
室温离子液体，是指室温或接近室温时呈液态的离子化合物，一般由体积相对较大的有机阳离子(如烷基咪唑盐、烷基吡啶盐、烷基季铵盐、烷基季膦盐)和相 对较小的无机或有机阴离子如六氟磷酸根([PF6]-)、四氟硼酸根([BF4]-)、硝酸根(NO3-)、三氟甲基磺酰亚胺 ([{CF3SO2}2N]-)等构成。离子液体，早期称作熔盐，在一战时期(1914)发现的第一个室温离子液体为乙基季胺硝酸盐。第一个使用熔盐作气 相色谱固定相的是Barber(1959年)，他利用硬脂酸和二价金属离子的盐(锰、钴、镍、铜和锌盐)作气相色谱固定相，测定了烃类、酮类、醇类和胺类 在156℃下的保留行为，具有特点的是用锰的硬脂酸熔盐作固定相可以很好地分离α-甲基吡啶和β-甲基吡啶，而使用相阿皮松一类固定相则完全不能分离。 1982年 Poole等研究了乙基季胺硝酸盐作气相色谱固定相的保留行为，发现这一固定相可在40-120℃范围内使用，是一种极性强于PEG20M 的具有静电力和氢键力的极性固定相，适于分离醇类和苯的单功能团取代衍生物，而胺类与固定相有强烈的作用，不能从色谱柱洗脱出来。就在这一年 Wilker 等报道了首例基于1-烷基-3-甲基咪唑为阳离子的室温离子液体,研究了它们的合成方法和在电化学中的应用。此后Armstrong等在1999年首先将 六氟磷酸 1-丁基-3-甲基咪唑 ([BuMIm][PF6] ) 及相应的氯化物([BuMIm][Cl] )用作气相色谱固定相 ,通过分离烃类、芳香族化合物、醛、酰胺、醚、酮、醇、酚、胺及羧酸类化合物 ,发现离子液体固定相具有双重性质:当分离非极性物质或弱极性物质时表现为非极性或弱极性固定相;当分离含有酸性或碱性官能团的分子时 ,表现为强极性固定相,并测定了[BuMIm][PF6]和[BuMIm][Cl]色谱固定相的麦氏(McRynolds)常数。之后的几年里 Armstrong等进行了一系列有关室温离子液体作气相色谱固定相的研究，奠定了室温离子液体固定相在实际中应用的基础。此后人们竞相研究室温离子液体 用作气相色谱固定相的问题，最近两年由于Supelco公司承袭了Armstrong研究团队的研究成果，把室温离子液体固定相商品化，出现了几种性能优 越的室温离子液体毛细管色谱柱,就促使许多研究者使用商品室温离子液体柱，分离一些复杂的难分离的混合物，因而也大大促进了离子液体气相色谱固定相的广泛 使用。(傅若农，化学试剂，2013，35( 6)： 481 ～ 490)
(1).室温离子液体气相色谱固定相的特点
室温离子液在许多领域得到了广泛的应用，如有机合成溶剂、催化剂用溶剂、基质辅助激光解析/电离质谱的液体基质、萃取溶剂、液相微萃取溶剂、毛细管电 泳缓冲溶液添加剂等，此外它们在分析化学领域得样品制备、分离介质中也得到充分的应用，气相色谱固定相是应用最多的一个领域。所以能得到如此广泛的应用是 因为它具有许多特殊的性能，联系到气相色谱固定相，它们非常适应毛细管色谱柱的多方面要求：
(a) 蒸汽压低
气相色谱固定相在使用温度下具有很低的蒸汽压是必要条件，室温离子液体具有很低的蒸汽压，它们能很好地满足气相色谱固定相的这一要求，例如现在使用较 多的1-丁基-3-甲基咪唑二(三氟甲基磺酰)亚胺([C4mim][NTf2])的蒸汽压见下表1,从表中数据看出在在不到180℃下蒸汽压不到1 mm Hg柱，这完全符合气相色谱固定相的要求。
表1 [C4mim][NTf2]在不同温度下的蒸汽压
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温度/℃ |
蒸汽压/P×102 (Pa) |
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184.5 |
1.22（0.92 mmHg柱） |
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194.4 |
2.29（1.72 mmHg柱） |
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205.5 |
5.07 (3.8 mmHg柱） |
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214.4 |
8.74 (6.6 mmHg柱） |
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224.4 |
15.2 (11.4 mmHg柱） |
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234.4 |
27.4 (20.5 mmHg柱） |
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244.3 |
46.6 (35.0 mmHg柱） |
(b) 粘度高
室温离子液体的粘度高，适合于气相色谱固定相的要求，而且在较宽的温度范围内变化不大，因为粘度低会影响色谱柱的分离效率和寿命，因为气相色谱固定相 在温度升高时趋向于降低粘度使液膜流动，造成膜厚改变，降低柱效，甚至液膜破裂降低柱寿命，室温离子液体的黏度比一般溶剂高很多，例如二乙基咪唑二(三氟 甲基磺酰)亚胺在20℃的粘度为34cP,n-己基-3-甲基咪唑氯化物在25℃的粘度为18000 cP，所以离子液体的粘度一般比传统溶剂高1到3个数量级 。
(c) 湿润性好
要使毛细管色谱柱的柱效提高，就要把固定相涂渍成一层均匀、牢固的薄膜，这样固定相对毛细管壁要有很好的湿润性，室温离子液体正好具备这样的特性，它 们的表面张力在 30 到 50 dyne/cm 之间，例如1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，和1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐分别为44.81, 39.02, 和 35.16 dyne/cm，这样的表面张力正好可以让固定相溶液湿润并铺展在未经处理的石英毛细管内壁上 。
(d)热稳定性好
大家都知道色谱柱的保留性能稳定性和柱寿命都与固定相的热稳定性有关，室温离子液体气相色谱固定相的热稳定性自然是十分重要的关键性能，离子液体的热 稳定性随其阴阳离子的不同有很大的差异，离子液体的阴离子具有低亲和性及共轭键时(如三氟磺酸基，三氟甲基磺酰亚胺阴离子)就有很高的热稳定性，反之具有 亲和性强的阴离子(如卤素基)其热稳定性就不好，一般像二烷基咪唑类离子液体固定相在220–250℃之间稳定，具有长烷基链的季鏻基离子液体可以在 335–405℃之间稳定，Anderson等研究了双阴离子咪唑和双吡咯烷鎓基离子液体的热稳定性。极性强的室温离子液体气相色谱固定相(比如商品名为 SLB-IL 111)的热稳定性虽然比不上二甲基硅氧烷的好，但是要比强极性固定相(氰丙基聚硅氧烷)的热稳定性要好，可是它的极性要比后者高，因而在分离脂肪酸甲酯 的能力要大大优于后者。从图1可以看出商品离子液体柱SLB-IL82的热稳定性大大优于一些常用的极性固定相。
图1 几种离子液体色谱柱和常规固定相色谱柱热稳定性的比较
(e) 极性高
固定相的极性是极为重要的关键指标，目前表示固定相极性的有Mcrynolds常数，和Abrham溶剂化参数，离子液体的极性也仍然使用这两种方法 表示，McReynolds常数是于120℃下以10种典型化合物测定所研究固定相的保留指数差(△I) ，用五种典型化合物(苯、正丁醇、2-戊酮、硝基丙烷和吡啶)的保留指数差(△I)之和来表示固定液的极性。Abraham表征固定相的方法是使用多种具 有特殊作用力的标样来表征固定相和溶质 n-电子对及π-电子对作用能力、与溶质的静电和诱导作用能力、与溶质的氢键碱性作用能力、与溶质的氢键酸性作用能力、与溶质的色散作用能力。表 2 是几种商品离子液体固定相的极性，从表中数据看出，室温离子液体的极性要比极性最强的TCEP(1,2,3-三(2-氰乙氧基)丙烷)还要高，这样在分离 脂肪酸甲酯和石油样品分析中就有特殊的用途。
表 2 几种商品离子液体固定相的极性
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商品色谱柱 |
组成 |
McRynolds 极性(P) |
相对极性数(p.N.)* |
|
SLB-IL 111 |
1,5-二（2,3-二甲基咪唑）戊烷二（三氟甲基磺酰基）亚胺 |
5150 |
116 |
|
SLB-IL 100 |
1,9-二(3-乙烯基咪唑)壬烷二（三氟甲磺酰基）亚胺 |
4437 |
100 |
|
TCEP |
1,2,3-三（2-氰乙氧基）丙烷 |
4294 |
94 |
|
SLB-IL 82 |
1,12-二（2,3-二甲基咪唑）十二烷二（三氟甲基磺酰基）亚胺 |
3638 |
82 |
|
SLB-IL 76 |
三（三丙基鏻六氨基）三甲氨（三氟甲基磺酰基）亚胺 |
3379 |
76 |
|
SLB-IL 69 |
未知 |
3126 |
70 |
|
SLB-IL 65 |
未知 |
2834 |
64 |
|
SLB-IL 61 |
1,12-二（三丙基鏻）十二烷-（三氟甲基磺酰基）亚胺-三氟甲基磺酸盐 |
2705 |
61 |
|
SLB-IL 60 |
1,12-二（三丙基鏻）十二烷二（三氟甲基磺酰基）亚胺（柱表面去活） |
2666 |
60 |
|
SLB-IL 59 |
1,12-二（三丙基鏻）十二烷二（三氟甲基磺酰基）亚胺 |
2624 |
59 |
|
SupelcoWax |
100%聚乙二醇 |
2324 |
52 |
|
SPB-5MS |
5%二苯基/95%二甲基）硅氧烷 |
251 |
6 |
|
Equity-1 |
100%聚二甲基硅氧烷 |
130 |
3 |
*相对极性数=(Px x 100)/ PSLB-IL 100= McRynolds 极性乘以100再除以SLB-IL 100的 McRynolds 极性
(McRynolds 极性指标是上世纪60年代中期研究建立的一种气相色谱固定相极性量度指标，近半个世纪一直在使用，W O McReynolds.J Chromatogr Sci,1970,8:685-691)
几种离子液体色谱柱的结构和性能见表3
表3：几种离子液体色谱柱的结构和性能
3、几种商品离子液体色谱柱在脂肪酸甲酯分离中应用举例，见表4
表4 离子液体色谱柱在脂肪酸甲酯分离中应用
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1 |
SLB-IL111 |
奶油中的脂肪酸 |
使用200m 长的SLB-IL111色谱柱可以很好地分离奶油中的脂肪酸，包括顺反和位置异构体 |
1 |
|
2 |
SLB-IL 82 和 SLB-IL 100
|
水藻中的脂肪酸 |
这两种商品离子液体柱用于分离水藻中的脂肪酸，具有很好的选择性和低流失，可以得到详细的脂肪酸分布，这是一种分析各种脂肪酸的色谱柱。 一维：聚二甲基硅氧烷 二维：SLB-IL 82 和 SLB-IL 100 |
2 |
|
3 |
SLB-IL100 |
鱼的类脂中反式20碳烯酸顺反异构体的分析 |
用60m长色谱柱可把C20:13和C20:11异构体得到基线分离，分离因子1.02，分离度1,57 |
3 |
|
4 |
SLB-IL111 |
分离16碳烯酸顺反异构体和其他不饱和脂肪酸 |
如果不使用SLB-IL111柱就不可能发现岩芹酸（顺式-6-十八碳烯酸），可以把cis-8 18:1和cis-6 18:1基线分离。证明岩芹酸在人的头发、指甲和皮肤中是内源性脂肪酸。 |
4 |
|
5 |
SLB-IL111 |
分离脂肪酸顺反异构体 |
SLB-IL111 可以很好地分离cis-,trans-18:1和 cis/trans 共轭异构体脂肪酸 |
5 |
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6 |
SLB-IL100 |
牛奶和牛油中的脂肪酸顺反异构体 |
使用全二维GC，把离子液体柱用作第一维色谱柱 一维：SLB-IL100 二维：SGE BPX50 (50% 苯基聚亚芳基硅氧烷 |
6 |
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7 |
SLB-IL 100（快速柱） |
生物柴油中的脂肪酸甲酯(C1-C28) |
SLB-IL100是极性很高的固定相，可以排除样品中的饱和烴的干扰，减少了样品处理难度，免去使用全二维GC。 |
7 |
|
8 |
SLB-IL100 |
分离C18:1, C18:2, 和 C18:3顺反异构体 |
SLB-IL100是极性很高的固定相，可以很好地分离不饱和脂肪酸顺反异构体，优于二丙氰聚硅氧烷色谱柱 |
8 |
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9 |
SLB-IL111 SLB-IL100 SLB-IL82 SLB-IL76 SLB-IL61 SLB-IL60 SLB-IL59 |
评价7种商品离子液体固定相分离37种脂肪酸甲酯的分离性能 |
IL59, IL60, 和 IL61三种色谱柱性能近似，不能分离C18:1脂肪酸的顺/反异构体，所有的色谱柱度可以基线分离C18:2 顺/反, C18:3 n6/n3, 和 C20:3 n6/n3异构体，IL82柱以5℃/min程序升温，可以把实验的37种脂肪酸甲酯分离开 |
9 |
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10 |
SLB-IL59 SLB-IL60 SLB-IL61 SLB-IL76 SLB-IL82 SLB-IL100 SLB-IL111 |
用7种商品离子液体固定相分离脂肪酸甲酯的及和异构体 |
除去IL60柱以外所有色谱柱上对饱和脂肪酸的洗脱温度，随它们的极性降低而增加，当固定相极性增加是它们的等价链长急剧增加。还研究了脂肪酸甲酯在这些色谱柱上Abraham 的保留能量线性关系 |
10 |
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11 |
SLB-IL111 |
使用强极性离子液体色谱柱快速分离食用油中的反式脂肪酸 |
使用强极性薄液膜细内径离子液体毛细管柱（75 m × 0.18 mm i d , 0.18 μm）快速分离食用油(例如奶油)中的反式脂肪酸 |
11 |
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12 |
SLB-IL111 |
使用强极性离子液体色谱柱分析食用油中顺反式硬脂酸 |
在120℃柱温下可以分离所有cis-C18:1位置异构体，把柱温提高到160℃可以分离反-6-C18:1 和 反-7-C18:1异构体 |
12 |
表中文献
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有关离子液体固定相在分离脂肪酸时的一些选择性和分离特点在下一讲叙述。
